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細(xì)胞計(jì)數(shù)相關(guān)知識(shí)
培養(yǎng)的細(xì)胞在一般條件下要求有一定的密度才能生長(zhǎng)良好，所以要進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。 計(jì)數(shù)結(jié)果以每毫升細(xì)胞數(shù)表示。 細(xì)胞計(jì)數(shù)的原理和方法與血細(xì)胞計(jì)數(shù)相同。 在細(xì)胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細(xì)胞，總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比叫做細(xì)胞活力，由組織中分離細(xì)胞一般也要檢查活力，以了解分離的過(guò)程對(duì)細(xì)胞是否有損傷作用。 復(fù)蘇后的細(xì)胞也要檢查活力，了解凍存和復(fù)蘇的效果量需要計(jì)。
一、計(jì)數(shù)方法分類
第一類方法是直接計(jì)數(shù)法，利用耗材、設(shè)備，配合人工或自動(dòng)化完成細(xì)胞數(shù)量的計(jì)數(shù)。包括：血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法、細(xì)胞計(jì)數(shù)儀和流式細(xì)胞儀。
其中細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的原理又可以分為基于阻抗檢測(cè)細(xì)胞個(gè)數(shù)，和基于成像分析進(jìn)行計(jì)數(shù)，而流式細(xì)胞儀是利用散射光對(duì)管道內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。
第二類方法是間接計(jì)數(shù)法，最常見(jiàn)的有MTT，結(jié)晶紫染色、考馬斯亮藍(lán)染色法等。他們的原理基本上是依靠染色劑對(duì)細(xì)胞或細(xì)胞核進(jìn)行染色，然后配合機(jī)器讀取吸光值變化或人工觀察計(jì)算細(xì)胞核數(shù)量來(lái)完成計(jì)數(shù)。
我們的日常實(shí)驗(yàn)中，有大量需要計(jì)算細(xì)胞密度，從而進(jìn)一步計(jì)算接種濃度或數(shù)量的情況。如下圖所示，為一塊血球計(jì)數(shù)板 (Hemocytometer)，即我們常用的經(jīng)典的細(xì)胞計(jì)數(shù)工具。
在血球計(jì)數(shù)板上，刻有一些符號(hào)和數(shù)字，XB-K-25為計(jì)數(shù)板的型號(hào)和規(guī)格，表示此計(jì)數(shù)板分25個(gè)中格（即湯麥?zhǔn)剑?。?jì)數(shù)區(qū)邊長(zhǎng)為1mm，則計(jì)數(shù)區(qū)的面積為1mm，每個(gè)小方格的面積為1/400mm2。
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二、計(jì)數(shù)步驟
1.準(zhǔn)備細(xì)胞計(jì)數(shù)板：
在準(zhǔn)備計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸液之前，我們需要提前擦拭干凈計(jì)數(shù)板。所謂干凈的標(biāo)準(zhǔn)，就是在鏡下觀察計(jì)數(shù)板，見(jiàn)計(jì)數(shù)池內(nèi)沒(méi)有影響后期觀察的纖維或雜點(diǎn)。使用大量75%乙醇噴灑計(jì)數(shù)板，令流動(dòng)的乙醇帶下計(jì)數(shù)板上的灰塵及細(xì)碎纖維（文明操作，在乙醇流下的地方墊上干凈的布，或用廢液缸接著，不要流的到處都是）。使用一塊干凈柔軟的布（例如眼鏡布）擦拭干凈計(jì)數(shù)板和蓋玻片，將蓋玻片覆蓋在計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)池上方，將計(jì)數(shù)板轉(zhuǎn)移入超凈臺(tái)。
2.準(zhǔn)備細(xì)胞懸液，接入細(xì)胞計(jì)數(shù)板：
超凈內(nèi)消化細(xì)胞。取50~100μl的細(xì)胞懸液（必要時(shí)可提前將細(xì)胞懸液稀釋10倍或更高倍數(shù)），在上下兩個(gè)計(jì)數(shù)池的蓋玻片的邊緣滴上一滴細(xì)胞懸液，令其虹吸進(jìn)入計(jì)數(shù)池。強(qiáng)調(diào)動(dòng)作穩(wěn)定，勿推動(dòng)蓋玻片。因?yàn)榧?xì)胞計(jì)數(shù)并不需要嚴(yán)格無(wú)菌操作，因此可使用左手食指穩(wěn)住槍頭，再滴液體。再?gòu)?qiáng)調(diào)一點(diǎn)，左手食指可以接觸槍頭，但如前文細(xì)胞培養(yǎng)中所述，一定不能接觸槍柄部分，以免影響后面細(xì)胞培養(yǎng)的無(wú)菌操作。
細(xì)胞懸液進(jìn)入計(jì)數(shù)池后，靜置片刻，將計(jì)數(shù)板穩(wěn)定地轉(zhuǎn)移至顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)。強(qiáng)調(diào)穩(wěn)定，是為了避免因?yàn)榛蝿?dòng)導(dǎo)致細(xì)胞懸液不均勻，甚至晃出計(jì)數(shù)室。
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3.顯微鏡下的細(xì)胞計(jì)數(shù)板：
鏡下可見(jiàn)的計(jì)數(shù)池如下圖所示，分為兩種。本文以湯麥?zhǔn)綖槔?/p>
計(jì)數(shù)板由H形凹槽分為上下兩個(gè)計(jì)數(shù)池。將蓋玻片覆蓋在兩個(gè)計(jì)數(shù)池上方，形成深度為0.10mm的計(jì)數(shù)池。每個(gè)計(jì)數(shù)池又分為9個(gè)大格（下圖紅色邊框大方格），每個(gè)大格規(guī)格為1.00mm×1.00mm。其中，中央大方格又用雙線劃分為25個(gè)中方格（下圖綠色邊框中方格或圖中淺紅色區(qū)域），每個(gè)中方格用單線劃分為16個(gè)小方格（下圖藍(lán)色邊框小方格）。
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4.計(jì)數(shù)方法：
（1）推薦計(jì)數(shù)方法1：
如步驟3所述，推薦計(jì)數(shù)大方格（紅色邊框大方格）內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量，兩個(gè)計(jì)數(shù)池一共有8個(gè)大方格，計(jì)得數(shù)量記為N。計(jì)數(shù)原則：計(jì)上不計(jì)下，計(jì)左不計(jì)右。
則細(xì)胞懸液密度為：C1=(N/8)×104個(gè)/ml
推導(dǎo)：前述可知，每個(gè)大方格的容積為0.1mm3，即0.1×10-3cm3，即0.1×10-3ml，即C1=（N/8）/（0.1×10-3ml）=(N/8)×104個(gè)/ml
若計(jì)數(shù)前，細(xì)胞懸液稀釋倍數(shù)為M，則修正的細(xì)胞懸液密度為C=(N/8)×M×104個(gè)/ml
（2）備選計(jì)數(shù)方法2：
記中方格（綠色邊框中方格）細(xì)胞數(shù)量，兩個(gè)計(jì)數(shù)池共10個(gè)中方格，計(jì)得數(shù)量記為X。
則細(xì)胞懸液密度為：C2=(X/2)×5×104個(gè)/ml。
（3）兩種方法比較：
方法1計(jì)數(shù)面積較大，因此計(jì)數(shù)更為準(zhǔn)確，方法2計(jì)數(shù)面積較小，在細(xì)胞數(shù)量較多的情況下，計(jì)數(shù)速度更快。方法的選擇嘛，仁者見(jiàn)仁智者見(jiàn)智。
三、活細(xì)胞成像儀自動(dòng)計(jì)數(shù)
傳統(tǒng)計(jì)數(shù)方法不僅操作步驟繁多復(fù)雜，而且對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)也會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞損傷。
相比較之下，活細(xì)胞實(shí)時(shí)成像儀通過(guò)單個(gè)細(xì)胞面積計(jì)算細(xì)胞總量的方法就更加簡(jiǎn)便，可以最小化對(duì)細(xì)胞的干擾損傷，最大化實(shí)驗(yàn)效率。
在培養(yǎng)箱穩(wěn)定的環(huán)境中進(jìn)行靈敏、實(shí)時(shí)的活細(xì)胞分析，獲得有意義的數(shù)據(jù)。
使用經(jīng)實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證的方案和直觀的專用軟件，從而縮短解決問(wèn)題的時(shí)間，將更多時(shí)間用于研究。
利用熒光試劑組合（可與多種細(xì)胞培養(yǎng)模型和應(yīng)用兼容）從每個(gè)樣本中獲得數(shù)據(jù)豐富的信息。
通過(guò)無(wú)干擾、基于圖像的分析和專有的試劑保持細(xì)胞健康。
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