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活細(xì)胞成像儀在細(xì)胞相關(guān)實(shí)驗中的應(yīng)用，可以進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和生長曲線監(jiān)測、細(xì)胞監(jiān)測實(shí)驗、細(xì)胞劃痕實(shí)驗、細(xì)胞增殖實(shí)驗、細(xì)胞調(diào)亡實(shí)驗、細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗、細(xì)胞毒性實(shí)驗等。

● 細(xì)胞劃痕實(shí)驗protocol及注意事項：

（1） 實(shí)驗?zāi)康?/p>

1）探究細(xì)胞遷移運(yùn)動

2）探究細(xì)胞修復(fù)能力

3）探究細(xì)胞間相互作用

（2） 實(shí)驗原理

細(xì)胞遷移(Cell migration)：也稱為細(xì)胞移動、細(xì)胞爬行或細(xì)胞運(yùn)動，是指細(xì)胞在接收到遷移信號或感受到某些物質(zhì)的梯度后而產(chǎn)生的移動。它參與到很多生理和病理的活動中，如下：

①免疫：如淋巴細(xì)胞的定向遷移是其分化成熟和發(fā)揮功能的關(guān)鍵之一；②炎癥：炎癥反應(yīng)最重要的功能是將白細(xì)胞送到炎癥灶，白細(xì)胞遷移到炎癥部位并發(fā)揮其吞噬和組織損傷作用；③腫瘤轉(zhuǎn)移：腫瘤轉(zhuǎn)移是腫瘤惡化后最常見的活動，如侵入淋巴管、血管后隨脈管系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；④損傷修復(fù)：當(dāng)機(jī)體發(fā)生損傷時，免疫細(xì)胞和血小板會遷移到損傷部位，參與消炎和凝血；⑤胚胎發(fā)育：胚胎期不同類型祖細(xì)胞遷移至特異靶位以保證各組織、器官的正常發(fā)育。

細(xì)胞劃痕實(shí)驗（Cell scratch assay）是通過在細(xì)胞單層上劃痕并通過延時顯微鏡定期捕獲圖像，從而研究細(xì)胞遷移運(yùn)動、修復(fù)能力和細(xì)胞間相互作用的實(shí)驗室技術(shù)，基本原理是：在融合的單層細(xì)胞上人為制造一個空白區(qū)域，稱為“劃痕/傷口”，劃痕邊緣的細(xì)胞會逐漸進(jìn)入空白區(qū)域使“劃痕/傷口”愈合，于細(xì)胞遷移過程中在開始和定期捕獲圖像，通過測量不同時間點(diǎn)的劃痕間距并計算差值，可對細(xì)胞的遷移能力做出判斷。因其類似體外傷口愈合過程，又名傷口愈合實(shí)驗(Wound healing assay)?？捎糜诳梢杂^察藥物、基因等外源因素對細(xì)胞遷移、修復(fù)和相互作用的影響。

（3）儀器和試劑

1）儀器：細(xì)胞計數(shù)儀、臺式離心機(jī)、CO2培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、移液槍、移液管移液器、4℃和-20℃冰箱、6孔培養(yǎng)板、直尺、maker筆。

2）試劑：細(xì)胞適配培養(yǎng)基、FBS、PBS、胰酶、樣本溶劑。

（4） 實(shí)驗步驟

1）劃線：先用marker筆在6孔板背后，用直尺比著，均勻的劃橫線，大約每隔0.5~1cm一道，橫穿過孔，每孔至少穿過5條線；

2）鋪板：處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，接種于6孔培養(yǎng)板；細(xì)胞鋪板6w/孔，接種原則為過夜后融合率達(dá)到100%，每孔最終的培養(yǎng)基總量2mL；

3）細(xì)胞培養(yǎng)37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；

4）劃痕：第二天用200微升槍頭比著6孔板蓋子或直尺，平行或垂直于背后的橫線劃痕，槍頭要垂直，不能傾斜

5）清洗：PBS沖洗細(xì)胞3次，除去劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基；

6） 拍照：擦去6孔板背后的marker橫線劃痕。4倍鏡下進(jìn)行拍照，保證劃痕居中且垂直，注意背景一致，加入待測樣本，設(shè)置濃度梯度，可按0，6，12，24h時間點(diǎn)取樣，拍照。

7.）結(jié)果分析，使用Image J軟件打開圖片后，隨機(jī)劃取6至8條水平線，計算細(xì)胞間距離的均值或者劃痕面積均值。

8）數(shù)據(jù)處理：

細(xì)胞遷移率(傷口愈合率)=(初始劃痕面積-t時刻劃痕面積)/初始劃痕面積

細(xì)胞遷移率(傷口愈合率)=(初始細(xì)胞間距離均值-t時刻細(xì)胞間距離均值)/初始細(xì)胞間距離均值

（5）注意事項

1）劃線的目的只是為了輔助劃痕時劃的更直，有利于后續(xù)拍照分析，劃線會在拍照前擦去。

2）細(xì)胞接種數(shù)量需根據(jù)細(xì)胞生長速度和狀態(tài)而定，接種原則為過夜后融合率達(dá)到100%，即細(xì)胞間沒有空隙，否則會影響后續(xù)拍照分析。

3）同濃度不同孔之間劃痕最好使用同一只槍頭，減少劃痕距離的誤差。劃痕時槍頭垂直，不能傾斜，可比著直尺或孔板蓋，保持力度一致，一次性劃完。

4）沖洗時要溫柔，貼壁加入，避免沖掉單層細(xì)胞，反復(fù)多次沖洗，盡量洗掉所有的細(xì)胞碎片。

5）降低細(xì)胞增殖對遷移造成的假陽性結(jié)果的方法：①使用無血清或低血清培養(yǎng)基(<2%)可降低細(xì)胞增殖對實(shí)驗結(jié)果的影響；②一般認(rèn)為24h為細(xì)胞的一個周期，在選取合適的時間點(diǎn)(6，12，24h)檢測劃痕寬度時，最好不要超過細(xì)胞一個周期的時間；③如果要單純考慮細(xì)胞遷移，可以先用絲裂霉素(1µg/ml)處理1h，抑制細(xì)胞的分裂。

6）盡量保證各個劃痕寬度一致, 人工槍頭制造劃痕難以保證劃痕寬度的一致性，影響實(shí)驗結(jié)果，這也是該方法最大的缺陷，有條件的同學(xué)可以選擇culture Insert（如下圖），將細(xì)胞接種于Dish中間的Insert，培養(yǎng)。細(xì)胞長滿Insert區(qū)域后用鑷子移除Insert即可產(chǎn)生500um、1000um寬度的劃痕。