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實(shí)驗(yàn)時間

    2025年05月29日14：50-15：50。

實(shí)驗(yàn)設(shè)備及廠家

    CELLImage Mini全自動活細(xì)胞成像儀（聯(lián)慶瑞奇）、離心機(jī)（國產(chǎn) ） 。

實(shí)驗(yàn)耗材及廠家

    24孔板（國產(chǎn)）、離心管（國產(chǎn)）等

實(shí)驗(yàn)試劑實(shí)驗(yàn)試劑

    線粒體綠色熒光探針（國產(chǎn)）、DAPI細(xì)胞核染料（逸漠生物）、完全培養(yǎng)基（逸漠生物）、PBS緩沖液（逸漠生物）等。

細(xì)胞類型

    A375細(xì)胞為例。

 

一、活細(xì)胞線粒體熒光探針標(biāo)記實(shí)驗(yàn)步驟

1、Mito-Tracker Green儲存液的配制

無水DMSO(anhydrous dimethylsulfoxide)配制Mito-Tracker Green至終濃度為1mM。配制后可以-20℃或更低溫度避光保存。

2、Mito-Tracker Green工作液的配制

  2.1、取少量1mMMito-TrackerGreen儲存液按照1:5000-1:50,000的比例加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，使最終濃度為20-200nM。取1μlMito-Tracker Green加入到5ml或50ml細(xì)胞培養(yǎng)液中。混勻后即為Mito-Tracker Green工作液

  2.2、Mito-Tracker Green工作液使用前需37℃預(yù)溫育。注:工作液中Mito-Tracker Green的濃度可以根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。為降低背景，在染色效果可以接受的范圍內(nèi)，建議盡量使用較低濃度的Mito-Tracker Green。

3. 線粒體的熒光標(biāo)記

  3.1 去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入步驟2配制好的并37C預(yù)溫育的Mito-Tracker Green染色工作液，與細(xì)胞37℃共孵育15-45分鐘。

  3.2 去除Mito-Tracker Green染色工作液。

 

二、 細(xì)胞核染色

1、DAPI染色液的稀釋

    DAPI工作液濃度通常為 1-10 µg/mL，將1mg/ml DAPI原液吸取10ul加入990ul ddH2O中，充分混勻。

2、染色步驟

  2.1、將 DAPI 工作液取100ul加入到完成線粒體熒光標(biāo)記的細(xì)胞孔內(nèi)，染色時間為 10-30 min，具體時間可根據(jù)細(xì)胞類型和實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行調(diào)整。

  2.2、染色完成后用PBS緩沖液輕輕洗滌細(xì)胞3次，每次 5 分鐘，以去除未結(jié)合的 DAPI染色液。

三、圖像采集

    將完成線粒體熒光標(biāo)記和細(xì)胞核染色的孔板放置于CELLImage Mini全自動活細(xì)胞成像儀觀察并進(jìn)行圖像采集，此時可觀察到線粒體呈明亮的強(qiáng)熒光染色，細(xì)胞核呈明亮的藍(lán)色。

 

四、實(shí)驗(yàn)圖像展示

五、實(shí)驗(yàn)總結(jié)

    CELLImage全自動活細(xì)胞成像儀在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)長時程、無干擾、高通量的監(jiān)測細(xì)胞實(shí)驗(yàn)全程的生長變化，記錄細(xì)胞增殖、遷移、凋亡等生命活動的變化過程，實(shí)現(xiàn)動態(tài)研究調(diào)控物質(zhì)對細(xì)胞的影響；CELLImage還支持紅、綠、藍(lán)三通道熒光成像，可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率等熒光成像實(shí)驗(yàn)的動態(tài)監(jiān)測，記錄細(xì)胞熒光的動態(tài)變化；CELLImage通過設(shè)置實(shí)驗(yàn)程序，自動觀測細(xì)胞并拍照記錄，具有生長曲線、熒光強(qiáng)度、Z軸疊加、大圖拼接等多種圖像數(shù)據(jù)自動分析功能，實(shí)驗(yàn)全程減少人力提高效率，適用一切細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的動態(tài)監(jiān)測和分析。